CPC 最佳植物保护实践

支持野外物种生存

关于组织培养和冷冻保存的关键信息
  • 组织培养和 冷冻保存 是用于生产少量种子或不耐干燥或冷冻的种子的特殊物种的替代储存方法。
  • 与传统种子储存相比,充分储存特殊物种需要专业知识、基础设施和更多资源。
  • 由于许多稀有植物物种的特定物种协议是未知的,因此植物保护领域是一个开创性的研究领域。皇冠官方手机app从业者有机会为该领域做出重大贡献。

为什么冷冻保存对濒临灭绝的本土植物很重要?

冷冻保存是一种将组织储存在液氮中的方法,对于珍稀植物保护变得越来越重要。这是因为许多植物物种,包括大... 阅读更多

特殊植物是那些不能使用传统种子库方法长期保存的植物。这包括几乎没有或没有种子可用于储存的物种,种子不耐受的物种 干燥 和冷冻,或可以忍受干燥但不能冷冻的种子,或只能在 –20°C 下储存少于 10 年的物种。为了 异地 保护,这些物种需要替代方法 常规存储, 如 冷冻保存 and 体外 方法。世界上许多植物物种都可能适合这些储存类别(参见 Seaton 等人,2018 年)。一个特殊物种的保护收藏的主要目的是支持该物种的生存并降低其灭绝风险,因此准确记录 出处、分化的母系和多样化的遗传表现是先决条件。

冷冻保存或组织培养是替代的储存过程 常规存储,但如果从业者能够将组织培养或冷冻保存的植物部分恢复到能够移植到野外的有根植物,这些替代方法才是真正的保护解决方案。与种子研究一样,与稀有野生物种相比,对农业或商业上重要的物种所做的工作要多得多。随着越来越多的 CPC 从业者进行组织培养和 冷冻保存 通过研究,人们对稀有物种的特定需求了解得越多,就越有可能检查模式。在科学发展的这个阶段,我们根据粮农组织的指导方针和最近的研究提供建议,指出这些研究机构之间的巨大差异源于这样一个事实,因为我们的物种稀少,我们通常很少有繁殖体来启动研究,我们很高兴能有任何生存!

空间和人员配备能力将始终影响机构的保护计划。与传统种子库相比,特殊物种需要更多的员工时间投入、员工的专业知识和更强大的基础设施。有鉴于此,我们鼓励从业者接触有经验的 体外 (tissue culture) and 冷冻保存 CPC 网络中的专家,如果他们计划创建内部程序或希望在特殊物种的研究项目上进行合作。

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确定存储要求

几位作者研究了可以帮助收集者的种子储存行为模式(参见参考资料)。从文献综述开始,检查以前是否对您的分类单元进行过任何研究。您可以检查同类物,但请注意,这并不总是可靠或结论性的。我们的夏威夷同事发现了一个属内的不同储藏行为(Walters、Weisenberger 和 Clark,个人通讯)。许多因素决定了种子对干燥或冷冻的耐受性的变化。以下是在种子中观察到的一些一般模式,这些模式往往能承受或不能承受正统储存。

特征 可能是正统派
(耐干燥和冷冻)
对正统存储的可疑容忍度
栖息地 干旱是特别可能的;如果不是在湿地生长,很可能 湿地,河岸
自然条件 种子通常会干燥和/或严重冻结 种子通常保持湿润,不会经历严重冻结
种子生产季节 不是春天 春天
生命形式 不是树 树木
种子库 执着的 不持久
休眠 处于休眠状态 无休眠
成熟时种子含水量 当它从植物上自然脱落时干燥 高 (30%–70%)
种子大小 非常大(鳄梨种子不耐干燥)或非常小(兰花种子和蕨类孢子需要储存在液氮中)
干燥敏感种子比例高的植物群 以正统种子为主的植物群
ANITAGrade, Arecales, Ericales, Fagales, Icacinales, Laurales, Magnoliales, Malpighiales, Myrtales, Orchidaceae, Oxalidales, Santalales, Salicaceae, Sapindale 茄科、禾本科、菊科、十字花科

用于保护工作的 Platanthera 物种的体外共生萌发

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收集特殊物种

在收藏之前做好准备。

兰花种子的收集和处理

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采集时,不要伤害采集地或稀有人群。

努力在适当的成熟阶段收集植物材料。

  • 注意您的加入中种子的成熟度。一般来说,最好收集成熟的孢子和种子。然而,未成熟的种子可能能够储存在液氮中或提取胚胎用于体外培养。
  • 收集适合您的方法的组织。 (看 Figure 2.1.)
  • 对于芽收集,收集年轻的生长或新生长的组织。通常,太老的组织不会通过扦插或组织培养进行传统繁殖。
  • 如果组织无法快速运送到实验室,请考虑进行体外现场收集。 (参见 Pence et al. 2002。)这将需要用 70% 乙醇消毒的器械收集组织。
  • 对于茎组织,记录芽的成熟度或发育状态(软/硬、叶扩张阶段、扩张程度、颜色等)
  • 拍摄种子荚或芽的照片以记录成熟的各个方面。

适当时,收集相关的土壤互惠者。

  • 对于陆生兰花,收集植物附近的土壤以捕获菌根(Batty 等人,2002 年)。
  • 菌根对于某些物种的萌发和栽培可能很重要。

在尽可能短的时间内以最好的状态运送到种子库或组织培养设施。

  • 处理速度越快,生存机会就越大。在运送种子之前,与种子库或繁殖设施的接收科学家交谈,以确保有人在场以迅速接收和处理加入。
  • 将种子或组织隔夜运送到种子库或繁殖设施。在运送到银行或培养设施时对标本提供特殊照顾。用几乎不湿(不浸湿)的纸巾包裹茎插条,并将每条母系线放入贴有标签的 Ziploc™ 袋中。使用泡沫塑料容器以尽量减少运输过程中的温度波动。不要用冰块或干冰运输。如果隔夜运输是不可能的,请考虑体外现场采集。

图 2.1 – 分生组织架构。尽管分生组织结构因物种而异,但了解目标稀有物种的分生组织结构将告知可用的繁殖选项。

图 2.2 – 体外培养的繁殖体类型和选择的多样性。体外培养可以用从种子中提取的孢子、种子或胚开始。来自顶端或节点的分生组织的生长尖端或从叶或根中提取的细胞可以作为体外培养的来源。

捕获有代表性的遗传多样性。

  • 在缺乏遗传数据的情况下,通过从具有不同外观的空间分离个体中收集种子或组织、从多个种群中收集并保持所有种质按母系分隔来捕获物种多样性的广度。
    • 考虑您正在收集/保存的繁殖体所代表的遗传多样性。营养物质(根或芽)代表与亲本相同的基因型。种子或孢子是可能来自多个亲本的受精产物,因此它们可能比营养物质具有更大的遗传多样性。 (看 图 2.2.)
    • 对于一些特殊的物种(蕨类植物和兰花),很容易从一个母系计划中获得数百种遗传相关的种子或孢子t.小心地从许多个体中收集种子或孢子,以增加您的种质所代表的潜在多样性。 (参见 CPC 最佳实践部分 “从野生稀有植物种群中收集种子。”)
  • 如果可能,在收集种子的同时收集平行的叶子样本用于 DNA 银行。

计划您的收藏抽样策略。

  • 使用种群大小和繁殖力来规划收集的抽样策略。
  • 收集的最终目标数量可能取决于机构处理和维护储存植物和活植物的能力。在收藏时考虑劳动力、空间和设施容量(Pence 2011)。
  • 尝试从每个种群中捕获尽可能多的无关个体。努力从 50 种母本植物中收集(见 CPC 最佳实践章节 “获取、维护和使用保护藏品的遗传指南;” 并分别维护母系。 常见问题 – 为什么要从 50 种母本植物中收集?
    • 如果从少于 100 个人的种群中收集种子,无论您是低温储存种子还是胚胎,都尝试从所有繁殖个体中捕获种子。对于较大的种群,来自 50 个母本植物的子样本就足够了。
    • 如果收集用于组织培养的芽,则根据植物的结构和节点处存在的腋芽数量收集基数。对于具有多个分支的物种,从每个母株中收集一到五个茎插条。对于具有单个分生组织的物种,在去除顶端分生组织之前,请确保植物结构支持腋芽。如果芽取自植物基部或土壤水平,它们可能需要使用表面消毒剂和抗菌剂进行严格的净化。
    • 遗传研究可以帮助确定野生基因在异地保护收藏中的表现(Griffith 等人,2015 年)。

设法捕获一个物种的至少五个种群。

如果它们存在,则设法跨越空间和时间捕获至少五个物种种群。看 “从野生稀有植物种群中收集种子。”

适当地记录收藏。

  • 基本登记信息包括:机构名称、登记号、收集者、收集日期、物种名称、科、地点信息、地理参考经纬度、场地所有权、许可文件和种群信息(种群中的个体总数、生殖个体,以及为收获的种子采样的个体数量)。 (看 加利福尼亚植物园的田间收集表示例.)
    • 提供栖息地信息可以提供有关该物种的发芽或组织培养要求的线索。推荐的领域包括光照和湿度条件、土壤类型、坡度方向和相关物种。提供栖息地和栖息地植物的照片。
    • 确保记录任何相关的收集物(例如,落叶、土壤、菌根真菌)并通过样品处理保持联系。
    • 根据您的机构协议收集和报告额外的入藏数据。遵守 植物园植物记录国际传输格式 and/or 达尔文核心标准 将允许轻松地将信息传输给合作伙伴。
  • 每个登记填写一份字段表格。只需为由至少相距 1 公里的种群收集的集合创建多个登录号和字段表格。
  • 通过提供给参与机构的在线表格将登录数据传输到 CPC 和 NLGRP 中共党员资源.进入此资源选项卡后,可以在“NLGRP 提交”选项卡上找到加入提交表。

特殊物种的实验室程序

在种子库或冷冻保存实验室,按照每种材料类型的步骤最大限度地提高其存活率。

为这些程序中的任何一个维护母系。为了获得最高的保护价值,请将材料保持在能够恢复可用于重新引入野外的整株植物的形式中。

最大限度提高种子存活率的步骤(怀疑有异常储存行为)

  • 通过进行发芽试验来测试新鲜种子的生存能力。例如,用 10 个种子的 10 个重复进行实验。根据您拥有的种子数量以及您最终想要存储的数量来减少测试的样本量。使用幼苗进行体外培养。
  • 确定种子是否适合常规储存的类别。请参阅“确定存储要求”框。
  • 如果它们符合正统类别,请参阅 CPC 最佳实践章节 “支持野生物种生存的传统种子库。”
  • 如果怀疑种子异常并且您有足够的种子,请测试五颗或更多种子以确定种子是否能够承受干燥。使用 CPC 最佳实践部分中描述的方法在盐溶液或二氧化硅上干燥种子, “清洁、加工、干燥和储存正统种子。”
  • 如果您有精确的刻度,请测试 5 到 10 个种子的单个种子含水量。如果您没有种子大小所需的精度标度,则可以在 NLGRP 上进行此测试。称重,在烘箱中晾干以除去水分直至重量无变化,然后重新称重。您可以计算水分含量。如果您的种子在脱落时水分含量很高,那么它很可能是特殊的。 (参见 Kew 信息表,测量种子水分状态.)
  • 一旦您确定种子是特殊的,接下来所需的步骤将根据种子大小而有所不同。对于大种子(橡树和更大的种子),提取胚胎并按照以下步骤进行体外和冷冻保存。 常见问题解答 – 如果我认为需要长期冷冻保存,我是否需要进行体外步骤?
  • 对于小种子,如兰花、直径小于 5 毫米的种子和蕨类孢子,使用风干方法干燥,将种子放入小容器(DSC 盘或微量离心管)中,装入低温储存吸管并放置变成液氮。

 在体外培养中最大限度地提高组织存活率的步骤

  • 查看之前对您的物种或属进行的任何体外研究,以指导您的程序细节。
  • 如果没有对您的物种或属进行其他工作,请执行体外培养的基本协议。记录每个阶段的步骤。如果组织对基本协议没有反应,请修改协议并再次测试。 (看 图 2.2 and 表 2.1.)
  • 采取措施尽量减少污染。
  • 在通风罩下用表面消毒剂处理进料。 常见问题 – 对于微繁殖、表面灭菌的第一阶段,我如何知道哪些消毒剂和浓度会在不损坏我的材料的情况下有效?
  • 在培养基中加入抗微生物剂(例如,杀真菌剂、PPM 等),特别是对于从野外获得的材料。
  • 定期监测生长和污染。根据需要刷新培养基。
  • 乘以栽培中的芽数。
  • 从每条母系中保留足够的材料,以防止该线随着时间的推移而磨损。
  • 慢慢地让植物远离阳光直射。
    • 从培养物中取出,转移到适当的土壤混合物中,并在塑料袋或玻璃下保持高湿度。慢慢增加通风。如果植物组织枯萎,请更换保护罩并以较慢的速度进行硬化。这个过程可能需要几个月的时间。
    • 与来自潮湿或潮湿生态系统的物种相比,适应干旱的植物,例如来自沙漠的植物,往往更难从组织培养适应环境条件。虽然仍在培养中,但可以考虑进行一些适应前的硬化,例如为培养物提供更大的通风、更高的光照或更低的营养,视物种而定。用通风盖更换密封盖,使管中的小苗变硬。从培养物中取出,转移到适当的土壤混合物中,并保持高湿度。

芽尖冷冻保存对橡树异地保护的潜力。

辛辛那提动物园和植物园的 Valerie Pence 博士虽然已经公布了为 20 多种橡树树种启动芽培养的协议,但橡树的冷冻保存... 阅读更多

表 2.1 微繁殖阶段

Stage Operations Comments
1. 建立和稳定 处理和预选目标植物以减少微生物污染的可能性。选择外植体类型:芽尖、花芽、腋芽、叶或胚。在适当的培养基上刺激腋生或不定枝形成。 预处理外植体以防止褐变。检查微生物菌落,以确定污染是来自植物组织内的真菌或细菌,还是来自未有效消毒的琼脂表面。
2. Multiply shoots 划分多分支外植体。将小芽放在含有激素的新培养基上,以刺激更多的芽发育。 检查是否有污染。
3. Roots form 通过将发育良好的芽转移到含有生长素的培养基中来诱导生根。 在这个阶段,小植物不太容易受到意外微生物污染。
4. Acclimate 去除有根植物并适应温室条件。 从根中取出琼脂。使用经过杀菌的盆栽混合物去除潜在的污染源。
昆明植物园的组织培养实验室拥有许多来自中国的稀有物种。 照片来源: 乔伊斯·马斯钦斯基。

图 2.3 – 体外和冷冻保存。从体外供体植物中,可以切除、消毒并放置在无菌营养培养基上的芽尖。细胞分裂素的应用将促进多芽生长。随着芽的增殖,可以进行冷冻保存选项的测试。将芽尖放在高蔗糖溶液上进行渗透保护,然后浸入、孵育或暴露于冷冻保护剂溶液(描绘的是封装脱水),暴露于液氮,然后储存。对于具有未知冷冻保存耐受性的物种,建议在该过程中进行实验步骤。实验成分可能包括渗透保护溶液的摩尔浓度、冷冻保护剂的暴露类型和持续时间、液氮暴露的速率和持续时间以及长期储存的持续时间。储存后,使用体外方法加热并回收吸头。

 最大限度地提高冷冻保存组织存活率的步骤

  • 进行种子测试(以上)后,放入适当的密封容器中,以储存在液氮中。
  • 对于已经在体外生长的枝条或种子胚胎,分离枝条尖端或胚胎。这可能需要解剖显微镜。最好的冷冻保存通常发生在小材料上。例如,最好使用尺寸小于 2 mm × 2 mm 的吸头。对于已经在体外生长的枝条或种子胚胎,分离尖端或胚胎(图 2.2 和 2.3)。
  • 在冷冻保存之前或之后对分离的种子胚胎进行表面消毒。
  • 遵循冷冻保存协议。对于冷冻保存协议中的每个步骤,测试一个对照组以确定组织是否在该步骤中幸存下来。
  • 在液氮暴露后争取 40% 的存活率。如果存活率低于 40%,则进行更多的冷冻保存实验以提高存活率,或储存更多材料。
  • 努力保留每个母系品系的每瓶至少 10 个芽尖的复制瓶。
  • 通过在 40°C 水浴中加热来回收材料。
  • 板到体外培养基上(见 Saad 和 Elshahed (2012) 媒体描述)。使用抗氧化剂来减少组织褐变。抗氧化剂的种类可能因物种而异。
  • 采取措施避免污染。
  • 记录过程中的所有步骤。
  • 一旦根形成,如上所述适应。

保持收藏中的特殊物种

在一个或多个活藏品中保存重复的种质(Fant 等人,2016 年)。

将所有储存特殊物种的尝试视为实验性的。

  • 因为我们有很多关于储存特殊物种的最佳方法的知识,所以所有的试验都应该使用最好的科学方法记录下来。
  • 为了最大限度地提高我们学习保持特殊物种在储存中存活的最佳方法的能力,不要将特殊物种储存在

如果有足够的材料可用,则在冷冻 5、10、15 和 20 年后监测加入的生存能力。

仔细记录实验协议。

  • 每当协议的步骤与控件进行比较时,报告控件和处理组的存活率。请记住,不成功的步骤将有助于未来的从业者。
  • 注意所用材料的年龄。
  • 为您的体外培养拍摄技巧拍照。
  • 注意平均拍摄尖端尺寸并拍摄此照片。
  • 注意尖端的状况和处理之间的任何外观差异(例如,有毛、形状、叶子是否存在等)。注意表型的存活。
  • 跟踪用于预培养、储存和恢复培养的培养基类型;注意使用的任何添加剂(例如,ABA、抗生素等);使用的冷冻保护剂;冷硬化处理;使用的冷却速度和玻璃化方法;以及对标准程序的任何修改。

为什么冷冻保存如此有趣?

植物保护主义者发现,许多植物无法使用传统的种子库技术进行储存。为了解决这个问题,研究人员正在探索... 阅读更多

国际标准

CPC指南参考
粮农组织植物遗传多样性基因库标准(FAO 2014)
种质获取标准
6.1.1 加入种质库的所有种质材料均应合法获得,并附有相关技术文件。
6.1.2 所有材料应至少附有粮农组织/生物多样性多作物护照描述符中详述的最少相关数据。
6.1.3 只应收集状况良好且成熟状态一致的材料,样本量应足够大,以使种质库成为可行的提议。
6.1.4 材料应在尽可能短的时间内以尽可能好的条件运送到种质库。
6.1.5 所有进来的材料都应该用表面消毒剂处理以去除所有附着的微生物,并在指定的接收区域进行处理,使其生理状态不改变。
非正统行为测试和含水量、活力和活力评估标准
6.2.1 种子的储存类别应立即通过评估其对脱水的反应来确定。
6.2.2 水分含量应根据繁殖体的不同成分和足够数量的植物单独确定。
6.2.3 应通过发芽试验和足够数量的个体来评估活力和活力。
6.2.4 在实验过程中,清洁的种子样品应储存在不允许任何脱水或水合的条件下。
顽固种子水化贮藏标准
6.3.1 水化储存应在饱和相对湿度条件下进行,种子应保存在密闭容器中,在它们可以承受的最低温度下不会损坏。
6.3.2 所有种子在水化储存之前都应进行消毒,并应清除受感染的材料。
6.3.3 储存的种子必须定期检查和取样,以检查是否发生了任何真菌或细菌污染,以及含水量和/或活力和活力是否下降。
体外培养和慢速生长储存标准
6.4.1 必须根据物种确定体外培养的最佳储存条件。
6.4.2 用于体外保存的材料应作为完整的幼苗或枝条或自然形成的物种的储存器官进行保存。
6.4.3 应建立定期监测系统,用于检查缓慢生长储存中的体外培养质量和可能的污染。
冷冻保存标准
6.5.1 选择用于冷冻保存的外植体应具有尽可能高的质量,并允许在切除和冷冻保存后继续发育。
6.5.2 冷冻方案中的每个步骤都应单独测试,并在外植体保留的活力和活力方面进行优化。
6.5.3 应制定措施以抵消切除和所有后续操作中活性氧 (ROS) 的破坏性影响。
6.5.4 取出后,应使用标准无菌程序对外植体进行消毒。

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